وائرس نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانا

زیادہ تر وائرسوں کے جینومک سلسلے معلوم ہو چکے ہیں۔نیوکلک ایسڈ پروبس جو ڈی این اے کے مختصر حصے ہیں جو تکمیلی وائرل ڈی این اے یا آر این اے سیگمنٹس کے ساتھ ہائبرڈائز کرنے کے لیے ڈیزائن کیے گئے ہیں۔پولیمریز چین ری ایکشن (PCR) وائرل کا پتہ لگانے کے لیے ایک زیادہ موثر تکنیک ہے۔ہائی تھرو پٹ تشخیصی طریقے حال ہی میں تیار کیے گئے ہیں۔

A. نیوکلک ایسڈ ہائبرڈائزیشن تکنیک

نیوکلک ایسڈ ہائبرڈائزیشن، جس میں بنیادی طور پر سدرن بلوٹنگ (سدرن) اور ناردرن بلوٹنگ (شمالی) شامل ہیں، وائرس کی تشخیص کے میدان میں تیزی سے ترقی پذیر نئی تکنیک ہے۔ہائبرڈائزیشن پرکھ کا استدلال ڈی این اے کے مختصر حصوں کا استعمال کرنا ہے (جسے "تحقیقات" کہا جاتا ہے) کو تکمیلی وائرل DNA یا RNA حصوں کے ساتھ ہائبرڈائز کرنے کے لئے ڈیزائن کیا گیا ہے۔حرارتی یا الکلائن ٹریٹمنٹ کے ذریعے، ڈبل پھنسے ہوئے ٹارگٹ ڈی این اے یا آر این اے کو سنگل اسٹرینڈ میں الگ کر دیا جاتا ہے اور پھر ٹھوس سپورٹ پر متحرک کیا جاتا ہے۔اس کے بعد، تحقیقات کو شامل کیا جاتا ہے اور ہدف ڈی این اے یا آر این اے کے ساتھ ہائبرڈائز کیا جاتا ہے۔چونکہ تحقیقات پر آاسوٹوپ یا غیر تابکار نیوکلائڈ کا لیبل لگا ہوا ہے، ہدف ڈی این اے یا آر این اے کا پتہ آٹوراڈیوگرافی کے ذریعے یا بایوٹین-ایوڈن سسٹم کے ذریعے کیا جا سکتا ہے۔چونکہ زیادہ تر وائرل جینومز کو کلون اور ترتیب دیا گیا ہے، اس لیے ان کا پتہ وائرس سے مخصوص ترتیب کو بطور پروب میں لگایا جا سکتا ہے۔فی الحال، ہائبرڈائزیشن کے طریقوں میں شامل ہیں: ڈاٹ بلاٹ، سیلز میں سیٹو ہائبرڈائزیشن، ڈی این اے بلاٹنگ (ڈی این اے) (سدرن بلوٹ) اور آر این اے بلوٹنگ (آر این اے) (شمالی دھبہ)۔

B.PCR ٹیکنالوجی

حالیہ برسوں میں، پی سی آر کی بنیاد پر ان وٹرو نیوکلک ایسڈ ایمپلیفیکیشن تکنیکوں کا ایک سلسلہ تیار کیا گیا ہے، تاکہ غیر حساس یا ناقابل کاشت وائرسوں کی جانچ کی جا سکے۔پی سی آر ایک ایسا طریقہ ہے جو وٹرو پولیمریز ری ایکشن کے ذریعے مخصوص ڈی این اے کی ترتیب کی ترکیب کرسکتا ہے۔پی سی آر کے عمل میں تین مراحل کا تھرمل سائیکل شامل ہے: ڈینیچریشن، اینیلنگ، اور ایکسٹینشن اعلی درجہ حرارت پر (93℃~95℃)، ڈبل پھنسے ہوئے ڈی این اے کو دو سنگل ڈی این اے اسٹرینڈز میں الگ کیا جاتا ہے۔پھر کم درجہ حرارت پر (37℃~60℃)، دو ترکیب شدہ نیوکلیوٹائڈ پرائمر تکمیلی ڈی این اے سیگمنٹس سے منسلک ہوتے ہیں۔جبکہ Taq انزائم (72℃) کے لیے مناسب درجہ حرارت پر، نئے DNA چینز کی ترکیب پرائمر 3'end سے تکمیلی DNA کو ٹیمپلیٹس کے طور پر اور سنگل نیوکلیوٹائڈز کو بطور مواد استعمال کرتے ہوئے شروع ہوتی ہے۔لہذا ہر چکر کے بعد، ایک ڈی این اے چین کو دو زنجیروں میں بڑھایا جا سکتا ہے۔اس عمل کو دہرانے سے، ایک سائیکل میں ترکیب شدہ ہر DNA چین کو اگلے سائیکل میں بطور ٹیمپلیٹ استعمال کیا جا سکتا ہے، اور ہر سائیکل میں DNA چینز کی تعداد دوگنی ہو جاتی ہے، جس کا مطلب ہے کہ PCR کی پیداوار کو 2n لاگ اسپیڈ میں بڑھا دیا جاتا ہے۔25 سے 30 چکروں کے بعد، الیکٹروفورسس کے ذریعے PCR کی پیداوار کی نشاندہی کی جاتی ہے، اور مخصوص DNA مصنوعات کو UV روشنی (254nm) کے تحت دیکھا جا سکتا ہے۔اس کی مخصوصیت، حساسیت اور سہولت کے فائدے کے لیے، پی سی آر کو بہت سے وائرل انفیکشن جیسے ایچ سی وی، ایچ آئی وی، سی ایم وی، اور ایچ پی وی کی طبی تشخیص میں اپنایا گیا ہے۔چونکہ پی سی آر بہت حساس ہے، یہ ایف جی کی سطح پر وائرس کے ڈی این اے کا پتہ لگا سکتا ہے، اس لیے آپریشن کو بہت احتیاط سے کیا جانا چاہیے تاکہ غلط مثبت سے بچا جا سکے۔اس کے علاوہ، نیوکلک ایسڈ ٹیسٹ میں مثبت نتیجہ کا مطلب یہ نہیں ہے کہ نمونے میں زندہ متعدی وائرس موجود ہے۔

پی سی آر تکنیک کے وسیع اطلاق کے ساتھ، مختلف ٹیسٹ کے مقصد کے لیے پی سی آر تکنیک کی بنیاد پر نئی تکنیک اور طریقے تیار کیے جاتے ہیں۔مثال کے طور پر، ریئل ٹائم مقداری PCR وائرل لوڈ کا پتہ لگا سکتا ہے۔حالت میں پی سی آر کا استعمال ٹشو یا خلیات میں وائرس کے انفیکشن کی شناخت کے لیے کیا جاتا ہے۔نیسٹڈ پی سی آر پی سی آر کی مخصوصیت کو بڑھا سکتا ہے۔ان میں سے، حقیقی وقت کی مقداری پی سی آر کو زیادہ تیزی سے تیار کیا گیا ہے۔بہت سی نئی تکنیکیں، جیسے TaqMan ہائیڈرولیسس پروب، ہائبرڈائزیشن پروب، اور مالیکیولر بیکن پروب، کو ریئل ٹائم مقداری PCR تکنیک میں جوڑ دیا گیا ہے، جس کا بڑے پیمانے پر کلینیکل ریسرچ میں استعمال کیا جاتا ہے۔مریضوں کے جسمانی رطوبت میں وائرل بوجھ کو درست طریقے سے شناخت کرنے کے علاوہ، یہ طریقہ منشیات کو برداشت کرنے والے اتپریورتی کا پتہ لگانے کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔لہذا، اصل وقتی مقداری پی سی آر بنیادی طور پر علاج کے اثرات کی تشخیص اور منشیات کی رواداری کی نگرانی میں لاگو ہوتا ہے۔

C. وائرل نیوکلک ایسڈز کی ہائی تھرو پٹ کا پتہ لگانا

نئی ابھرتی ہوئی متعدی بیماریوں کی تیزی سے تشخیص کی ضروریات کو پورا کرنے کے لیے، ڈی این اے چپس (ڈی این اے) کی طرح ہائی تھرو پٹ پتہ لگانے کے مختلف طریقے قائم کیے گئے ہیں۔ڈی این اے چپس کے لیے، مخصوص پروبس کو ترکیب کیا جاتا ہے اور بہت زیادہ کثافت میں چھوٹے سلیکون چپس سے منسلک کیا جاتا ہے تاکہ ڈی این اے پروب مائیکرو رے (DNA) بنایا جا سکے جسے نمونے کے ساتھ ہائبرڈائز کیا جا سکتا ہے۔ہائبرڈائزیشن کے سگنل کو کنفوکل مائیکروسکوپ یا لیزر سکینر کے ذریعے امیج کیا جا سکتا ہے اور کمپیوٹر کے ذریعے اس پر مزید کارروائی کی جا سکتی ہے اور مختلف جینز سے متعلق بہت بڑا ڈیٹا سیٹ حاصل کیا جا سکتا ہے۔ڈی این اے چپ کی دو قسمیں ہیں۔"سنتھیسس چپ" مندرجہ ذیل ہے: مخصوص اولیگونوکلیوٹائڈز کو براہ راست چپس پر ترکیب کیا جاتا ہے۔ایک اور ڈی این اے پول چپ ہے۔کلون شدہ جینز یا پی سی آر مصنوعات سلائیڈ پر ترتیب سے پرنٹ کی جاتی ہیں۔ڈی این اے چپ ٹیکنالوجی کا فائدہ ڈی این اے کی ترتیب کی ایک بڑی مقدار کا بیک وقت پتہ لگانا ہے۔پیتھوجین کا پتہ لگانے والی چپ کا تازہ ترین ورژن 1700 سے زیادہ انسانی وائرسوں کی ایک ساتھ شناخت کر سکتا ہے۔ڈی این اے چپ ٹیکنالوجی نے روایتی نیوکلک ایسڈ ہائبرڈائزیشن کے طریقوں کے مسائل کو حل کیا اور وائرل تشخیص اور وبائی امراض کے مطالعہ میں اس کے بہت وسیع استعمال ہیں۔